人體端粒酶逆轉錄酶hTERT表達實(shí)時(shí)定量檢測試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

  人體端粒酶逆轉錄酶hTERT表達實(shí)時(shí)定量檢測試劑是一種旨在運用SYBR綠色熒光染料作為標記信號，既方便、快速地進(jìn)行各種DNA模板的擴增，又實(shí)時(shí)檢測和定量分析擴增產(chǎn)物，即端粒酶逆轉錄酶活性的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗證明的。廣泛應用于腫瘤、衰老等研究。產(chǎn)品即到即用，性能穩定，無(wú)核酶污染，操作便捷，敏感高效，定量準確，重復性強，效果滿(mǎn)意，質(zhì)量保證。

技術(shù)背景

人體端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase；hTERT），又稱(chēng)hTRT、hTCS1 和hEST2，是端粒酶的核心結構，即催化亞體（catalytic subunit）。hTERT的功能性表達是端粒酶獲得活性的前提。hTERT可以激活端粒酶，使細胞獲得永生化。hTERT是端粒酶活性的限速決定成分，其mRNA表達水平與端粒酶活性之間具有密切的相關(guān)性。hTERT是一單拷貝基因，定位于5q15.33，屬于逆轉錄酶家族，具有進(jìn)化上的保守性，序列總長(cháng)約35kb，由16個(gè)外顯子和15個(gè)內含子組成。端粒酶特異性T-motif和7個(gè)同源保守序列的RT-motif分別位于不同的外顯子上。hTERTmRNA 還有7種不同的剪切轉錄本，分為缺失型與插入型兩類(lèi)。

產(chǎn)品內容

  引導液（Reagent A）            微升  

  逆轉液（Reagent B）                微升

  補充液（Reagent C）         毫升

  反應液（Reagent D）         微升

  內參液（Reagent E）         微升

  染色液（Reagent F）         微升

  封隔液（Reagent G）         毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)            1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；  染色液（Reagent F）避免光照，有效保證6月

用戶(hù)自備

RNA樣品：用于逆轉錄擴增的模板

PCR管：用于樣品操作的容器

恒溫水槽或干式恒溫儀：用于反應孵育

微型臺式離心機：用于沉降反應物

熒光定量PCR儀：用于熒光定量PCR反應

實(shí)驗步驟

實(shí)驗開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑和用戶(hù)自備的總RNA樣品置入冰槽里融化；同時(shí)將干式恒溫儀分別設置到70℃和37℃。然后進(jìn)行下列操作。

一、cDNA合成

1． 分別將融化的試劑盒里的試劑溶液渦旋震蕩2秒

2． 放進(jìn)微型臺式離心機瞬時(shí)離心5秒

3． 移出xx微升  引導液（Reagent A）到新的0.5毫升PCR管

4． 加入8微升用戶(hù)自備的RNA樣品（1微克總RNA樣品）

5． 用槍頭混勻

6． 放進(jìn)70℃干式恒溫儀孵育3分鐘

7． 即刻放進(jìn)冰槽里

8． 加入xx微升  逆轉液（Reagent B）

9． 用槍頭混勻

10． 放進(jìn)微型臺式離心機瞬時(shí)離心5秒

11． 放進(jìn)37℃干式恒溫儀孵育60分鐘

12． 即刻放進(jìn)冰槽里

13． 加入xx微升  補充液（Reagent C）稀釋?zhuān)靹?/span>

14． 置入冰槽里備用或放進(jìn)－20℃冰箱里保存

二、實(shí)時(shí)定量PCR

1． 一次反應總量為25微升

2． 分別移取xx微升  反應液（Reagent D）和  內參液（Reagent E）到2個(gè)0.5毫升PCR管，并做好標記

3． 分別加入2微升已知cDNA合成物（注意：可以根據標準曲線(xiàn)計算得知；參見(jiàn)注意事項9）

4． 分別加入xx微升  染色液（Reagent F）

5． 分別加入xx微升  補充液（Reagent C）到總量25微升

6． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機瞬時(shí)離心5秒

7． 使用1000微升槍頭加入xx滴  封隔液（Reagent G）（注意：參見(jiàn)注意事項12）

8． 即刻放進(jìn)熒光定量PCR儀

9． 熒光定量PCR反應程序為：

10． 采集數據，進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析

11． PCR產(chǎn)物置于－20℃保存備用

12． 或進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物的特異性：hTERT片段為120bp；內參GAPDH片段為150bp

三、表達計算

表達量：定義為相對于正常對照樣品的hTERT表達水平

GAPDH：內參，作為調節樣品水平的參考指標

對照：用戶(hù)可以使用hTERT低表達的正常細胞或組織作為比較對照，建議使用正常淋巴細胞

注意事項

1. 本產(chǎn)品為50次操作（包括50次cDNA合成，100次實(shí)時(shí)定量擴增）

2. 操作時(shí)，須戴手套

3. 本產(chǎn)品適合各種熒光定量PCR儀

4. 建議整個(gè)操作在4℃下進(jìn)行

5. 必須使用帶濾芯的槍頭

6. 所有器皿、離心管、液體等無(wú)RNA酶污染

7. 使用時(shí)，避免污染母液

8. 建議選用正常淋巴細胞作為正常對照或校正對照，以此作為評價(jià)hTERT的參考指標；用戶(hù)可以選用任何其它正常細胞或組織，例如腫瘤組織旁的正常組織等

9. 建議選用hTERT陽(yáng)性表達的MCF7細胞作為陽(yáng)性對照，以此構建標準曲線(xiàn)：縱坐標（Y軸）為Ct值，橫坐標（X軸）為已知細胞量對數值或拷貝數或RNA量等，其*有效用量作為樣品檢測量的標準

10. 建議使用無(wú)模板作為陰性對照

11.   內參液（Reagent E）為看家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；GAPDH）作為比較分析時(shí)樣品測試用量校正統一的參考標準

12. 根據用戶(hù)PCR儀的性能，決定是否加入  封隔液（Reagent D）

13. 配制完成后，即刻進(jìn)行擴增反應，以確保反應物的活性

14. 試劑避免反復凍融

15. PCR擴增反應的最初3個(gè)循環(huán)為定量基線(xiàn)；3至15個(gè)循環(huán)的熒光信號的10倍值為熒光閾值；熒光信號達到閾值所需的循環(huán)數為Ct值（參考圖像如下）

16. Ct值可以作為hTERT表達的計量單位，也可以根據標準曲線(xiàn)轉換為表達分子數進(jìn)行計量

17. 本公司提供系列端粒酶活性檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無(wú)核酶污染