植物查爾酮合成酶（chalcone synthase）活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

  植物查爾酮合成酶（chalcone synthase）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過(guò)香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A縮合反應系統中釋放出巰基輔酶A，使用Ellman試劑后，產(chǎn)生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物吸光峰值的變化，即采用比色法來(lái)測定植物裂解樣品中酶活性的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗證明的。其適合于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）、胚胎葉（cotyledon）、上胚軸（epicotyl）等查爾酮合成酶的活性檢測。產(chǎn)品嚴格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩定。

技術(shù)背景

查爾酮合成酶（chalcone synthase；CHS；EC2.3.1.74）是聚酮體合成酶（polyketide synthase；PKS）大家屬中的一員，是啟動(dòng)類(lèi)黃酮（flavonoid）化合物合成通路中*步關(guān)鍵酶，形成植物系統性獲得性抗性（systematic acquired resistance；SAR）的基礎。查爾酮合成酶存在于細菌、植物和真菌中。在所有裸子植物（gymnosperm）和被子植物（angiosperm）的各種不同發(fā)育階段中的不同組織中表達。查爾酮合成酶為同源二聚體，分子量為40至4000Kd，由環(huán)境壓力，包括UV照射、傷口、病原菌襲擊等誘導，通過(guò)丙二酰輔酶A脫羧基反應（decarboxylation）、與香豆酰輔酶縮合、聚酮體鏈延展（chain elongation）、中間產(chǎn)物環(huán)狀化（cyclization）和芳構化（aromatization）產(chǎn)生查爾酮，一種類(lèi)黃酮化合物前體，作為化學(xué)信使，由此生成各種后續繼發(fā)性代謝化合物，參與抗病原微生物例如異黃酮植物保護素（isoflavonoid phytoalexin）、花青素花色素化、抵御環(huán)境壓力（UV光保護）、花粉育性（pollen fertility）、抗氧化、共生根系結瘤（symbiotic root nodulation），以及作為抗生素、免疫抑制劑、抗腫瘤和抗真菌的藥物作用。還在細菌的囊腫形成和阿米巴細胞分化中產(chǎn)生作用。基于香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A，在敏感性抑制劑木犀草素（Luteolin）存在與否的情況下，受到查爾酮合成酶的作用，縮合產(chǎn)生查爾酮，并釋放出巰基輔酶A（CoA-SH），進(jìn)而與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5,-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過(guò)其吸收峰值的變化（412nm波長(cháng)），來(lái)定量分析查爾酮合成酶的活性。查爾酮合成酶反應系統為：

產(chǎn)品內容

  清理液（Reagent A）       毫升

  裂解液（Reagent B）       毫升

  緩沖液（Reagent C）       毫升

  反應液（Reagent D）       毫升

  底物液（Reagent E）        毫升

  專(zhuān)性液（Reagent F）        微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)           1份

保存方式

保存  緩沖液（Reagent C）、  反應液（Reagent D）和  底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；  反應液（Reagent D）和  底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶(hù)自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織細胞

微型臺式離心機：用于樣品操作

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實(shí)驗步驟

一、 樣品準備 

1． 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 

2． （選擇步驟）放進(jìn)預冷的15毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入xx毫升  清理液（Reagent A）清洗1次

4． 即刻用刀片切碎組織

5． 放進(jìn)一個(gè)預冷的15毫升錐形離心管

6． 加入預冷的xx毫升  裂解液（Reagent B）

7． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

8． 即刻放進(jìn)預冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）

9． 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進(jìn)4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）

10． 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個(gè)新的預冷的15毫升錐形離心管

11． （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見(jiàn)的殘渣，重復離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）

12． 即刻移入到1.5毫升離心管

13． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

14． 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

二、 測定準備

1． 開(kāi)啟并設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(cháng)412nm，間隔5分鐘，讀數7次（共30分鐘），并置零 

2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；  反應液（Reagent D）和  底物液（Reagent E）避免光照；  緩沖液（Reagent C）室溫下預熱

三、 背景對照測定

1． 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升  底物液（Reagent E）

3． 在30℃溫度下孵育3分鐘

4． 加入20微升待測樣品（200微克蛋白）（注意：樣品須清澈） 

5． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

6． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照（30分鐘讀數－0分鐘讀數）

四、 樣品總活性測定

1． 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升  反應液（Reagent D）

3． 加入xx微升  底物液（Reagent E）

4． 上下傾倒數次，混勻

5． 在30℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入20微升待測樣品（200微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數（30分鐘讀數－0分鐘讀數） 

五、 樣品非特異活性測定

檢測開(kāi)始前，分別移取xx微升  專(zhuān)性液（Reagent F）和待測樣品（注意：200微克蛋白）到1.5毫升離心管，混勻后，放進(jìn)30℃培養箱里孵育15分鐘。然后繼續下列操作。

1． 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升  反應液（Reagent D）

3． 加入xx微升  底物液（Reagent E）

4． 上下傾倒數次，混勻

5． 在30℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入40微升上述預處理的待測樣品 

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數（30分鐘讀數－0分鐘讀數）

六、計算樣品活性

1） 樣品總活性和非特異活性計算

2）樣品特異活性計算

七、 酶標儀測定

1）樣品總活性測定

1． 在96孔板上做好相應標記：背景對照和待測樣品

2． 分別移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到96孔板的所有孔里

3． 加入xx微升  緩沖液（Reagent C）到背景對照孔里

4． 加入xx微升  反應液（Reagent D）到待測樣品孔里

5． 分別加入xx微升  底物液（Reagent E）到96孔板的所有孔里

6． 在30℃溫度下孵育3分鐘

7． 分別加入20微升待測樣品（200微克蛋白）到96孔板的所有孔里（注意：樣品須清澈）

8． 輕輕搖動(dòng)96孔板

9． 即刻放進(jìn)酶標儀檢測：0分鐘讀數和30分鐘讀數數

10． 活性計算：

2）樣品非特異活性測定

檢測開(kāi)始前，分別移取xx微升  專(zhuān)性液（Reagent F）和待測樣品（注意：200微克蛋白）到1.5毫升離心管，混勻后，放進(jìn)30℃培養箱里孵育15分鐘。然后繼續下列操作。

1． 在96孔板上做好相應標記：待測樣品

2． 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到96孔板的孔里

3． 加入xx微升  反應液（Reagent D）

4． 加入xx微升  底物液（Reagent E）

5． 在30℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入40微升上述預處理的待測樣品 

7． 輕輕搖動(dòng)96孔板

8． 即刻放進(jìn)酶標儀檢測：0分鐘讀數和30分鐘讀數數

9． 活性計算：

3） 樣品特異活性計算

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次操作

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 建議使用比色皿測定

4． 樣品須澄清，至關(guān)重要 

5． 加樣后3秒內比色測定

6． 測定值由低到高變化；測定可持續60分鐘

7． 比色測定后，比色皿須清洗*

8． 樣本測定30分鐘讀數高于0分鐘讀數表明具有酶活性

9． 如果待測樣本為總蛋白，其蛋白濃度為200微克/20微升（本公司提供    Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

10． 如果待測樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調整樣品濃度

11． 查爾酮合成酶單位活性定義為：在30℃，pH 7.8條件下，每分鐘內能夠釋放1微摩爾輔酶A所需的酶量作為一個(gè)活性單位

12． 本公司提供系列聚酮體代謝檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感