MB50083 v.A

 線(xiàn)粒體呼吸鏈復合物V活性光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

 線(xiàn)粒體呼吸鏈復合物V（F0F1-ATP酶/ATP合成酶）活性光度法定量檢測試劑是一種旨在使用丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環(huán)法反應系統，測定與ATP合成對應的ATP水解產(chǎn)生ADP過(guò)程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光度法測定樣品中酶活性的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗證明的。其適合于各種純化線(xiàn)粒體樣品（動(dòng)物、人體、酵母）以及細胞或組織裂解懸液樣品的F0F1-ATP酶/ATP合成酶的特異性活性檢測?？?/span>用于心肌、能量代謝、蛋白組學(xué)、病理生理學(xué)、神經(jīng)病變等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩定，反應優(yōu)化，檢測敏感。

技術(shù)背景

線(xiàn)粒體呼吸鏈復合物V，通常稱(chēng)為ATP合成酶（ATP synthase）、F型ATP酶（F type ATPase）和F1F0 ATP酶（F1F0 ATPase），是線(xiàn)粒體氧化磷酸化的*反應。其分子量為500KD，含有十六個(gè)亞單位，其中兩個(gè)：ATP酶6和8為線(xiàn)粒體DNA編碼的。ATP酶主要有兩個(gè)結構域：F0為質(zhì)子通道，由幾個(gè)膜蛋白構成，包括a、b、c、d、e、F6、A6L、OSCP（oligomycin sensitive conferring protein）等；和F1催化活性結構域，由水溶性的α3β3γδε蛋白構成。其特征性的酶活性是寡霉素敏感的ATP合成酶。復合物V的主要功能在于產(chǎn)生大部分細胞所需的能量ATP。ATP的合成需要線(xiàn)粒體內膜電子傳遞到氧分子時(shí)，呼吸鏈蛋白所產(chǎn)生的質(zhì)子梯度變化。質(zhì)子通過(guò)F0結構域傳遞到基質(zhì)，激活F1催化活性結構域，促使ATP合成。該酶異常會(huì )導致心肌和神經(jīng)系統疾病?；贏(yíng)TP，在寡霉素參與下，受到F1F0 ATP酶的水解，進(jìn)而通過(guò)丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），產(chǎn)生的吸光峰值的變化（340nm），來(lái)定量分析F1F0 ATP酶活性。其反應系統為：

F1F0 ATPase

 ATP   =    ADP  +  Pi

pyruvate kinase

Phosphoenolpyruvate  +  ADP       →      pyruvate  +  ATP

lactate dehydrogenase

pyruvate  +  NADH       →      lactate  +  NAD⁺

  （高吸收峰） （低吸收峰）

產(chǎn)品內容

 緩沖液（Reagent A）  20毫升

 反應液（Reagent B）      2.5毫升

 陰性液（Reagent C）     2毫升

 底物液（Reagent D） 500微升

 專(zhuān)性液（Reagent E）   250微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)      1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融； 反應液（Reagent B），避免光照，有效保證6月

用戶(hù)自備

比色皿：用于光度分析的容器

分光光度儀：用于光度分析

培養箱：用于孵育反應物

實(shí)驗步驟

實(shí)驗開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化； 反應液（Reagent B）注意避光。然后進(jìn)行下列操作。

• 測定準備

• 準備好待測樣品（例如純化線(xiàn)粒體樣品等），置于冰槽里 
• 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(cháng)為340nm，間隔30秒，讀數11次（共5分鐘），并置零
•  緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取780微升 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升 反應液（Reagent B）
• 加入20微升 底物液（Reagent D）
• 放進(jìn)30℃培養箱里孵育3分鐘
• 加入100微升 陰性液（Reagent C）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長(cháng)讀數0分鐘 －340波長(cháng)讀數1分鐘或5分鐘

• 樣品總活性測定

• 移取780微升 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升 反應液（Reagent B）
• 加入20微升 底物液（Reagent D）
• 放進(jìn)30℃培養箱里孵育3分鐘
• 加入100微升待測樣品（注意：10微克總線(xiàn)粒體蛋白）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數：340波長(cháng)讀數0分鐘 －340波長(cháng)讀數1分鐘或5分鐘

• 樣品非特異活性測定

實(shí)驗開(kāi)始前，移取100微升待測樣品（注意：10微克總線(xiàn)粒體蛋白）到1.5毫升離心管，加入20微升 專(zhuān)性液（Reagent E），混勻后，放進(jìn)30℃培養箱里孵育15分鐘。然后置于冰槽里備用

• 移取760微升 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升 反應液（Reagent B）
• 加入20微升 底物液（Reagent D）
• 放進(jìn)30℃培養箱里孵育3分鐘
• 加入120微升上述預處理的待測樣品
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數：340波長(cháng)讀數0分鐘 －340波長(cháng)讀數1分鐘或5分鐘

• 計算樣品活性

1）樣品活性（總活性和非特異活性）

【（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數】÷【0.1（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數 X 1或5（反應時(shí)間；分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾NADH/分鐘

2）樣品特異活性

樣品總活性－樣品非特異活性＝樣品特異活性

注意事項

• 本產(chǎn)品為21次操作（10個(gè)樣本），包括1次背景對照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統操作過(guò)程中，背景測定只需1次
• 線(xiàn)粒體樣品檢測前，建議凍存融解（－70℃至37℃）循環(huán)3次
• 如果增強酶活檢測，建議使用 線(xiàn)粒體復合物待測樣品預處理試劑盒－GMS10342
• 建議線(xiàn)粒體懸液使用0.25 M SUCROSE和2 mM EDTA，pH9.0；忌用磷酸緩沖溶液
• 建議使用線(xiàn)粒體裂解懸液，而不是細胞裂解懸液。如果使用細胞裂解懸液，*須澄清；第二須加50微克
• 加入樣品后3秒內即刻光度測定
• 反應1分鐘后光度測定值趨于穩定；測定值由高到低變化；測定可以持續5分鐘
• 測定值由高到低變化，即0分鐘測定讀數高于1分鐘或5分鐘測定讀數，表明有酶活性
• 光度測定后，比色皿須清洗*
• 建議待測樣本線(xiàn)粒體蛋白濃度為10微克/100微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調整（本公司提供 線(xiàn)粒體溶解試劑盒GMS10018為后續的線(xiàn)粒體蛋白濃度測定的預處理試劑盒和  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 樣品特異活性是指寡霉素敏感的ATP合成酶，去除其它干擾因素（例如復合物I/II/III/IV等）
• 線(xiàn)粒體呼吸鏈復合物V酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列線(xiàn)粒體及其酶類(lèi)技術(shù)產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準確