MB10016.13 v.A

    細菌氧化應激活性氧高質(zhì)熒光測定試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

    細菌氧化應激活性氧高質(zhì)熒光測定試劑是一種旨在通過(guò)透膜熒光染色劑氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯，在細菌氧化條件下，產(chǎn)生熒光，來(lái)定量檢測細菌活性氧族的生成和增加的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗證明的。其適用于各種實(shí)驗用細菌菌株氧化應激活性氧的分析。產(chǎn)品嚴格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)易，活體檢測，性能穩定，滯留持久，熒光清晰。

技術(shù)背景

細菌作為模式生物，是環(huán)境化學(xué)毒性研究的常用工具?；钚匝醯臋z測可以用于諸如多環(huán)芳烴化合物或重金屬的毒性作用以及修復（remediation）的評價(jià)指標。超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過(guò)氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過(guò)氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過(guò)氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線(xiàn)態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導致細胞衰老或凋亡。氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是取代二氯二氫熒光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升級產(chǎn)品，一種*自由通過(guò)細胞膜，并在細胞內長(cháng)期滯留而不易外漏的染色劑。一旦被過(guò)氧化氫、羥自由基或氫氧基、過(guò)氧化基、次氯酸等氧化，便產(chǎn)生熒光。據此測定細菌活性氧族的濃度。

產(chǎn)品內容

    清理液（Reagent A）    200毫升

    染色液（Reagent B）    250微升

    稀釋液（Reagent C）     10毫升

    溶解液（Reagent D）      5毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)    1份

保存方式

保存    染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶(hù)自備

1.5毫升離心管：用于染色的容器

微型臺式離心機：用于樣品操作

培養箱或恒溫水槽：用于染色孵育

200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板：用于熒光定量分析

熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于熒光定量分析

實(shí)驗步驟

• 直接測定

• 準備好1毫升新鮮的待測菌液（OD600＝0.5；1 X 10⁸細胞/毫升）
• 移取200微升到1.5毫升離心管
• 加入5微升    染色液（Reagent B），混勻
• 轉移到200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板
• 放進(jìn)37℃熒光分光光度儀或熒光酶標儀檢測（激發(fā)波長(cháng)490nm，散發(fā)波長(cháng)530nm）：每隔5分鐘測讀一次，持續120分鐘――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量增高
• 構建活性氧和時(shí)間關(guān)系曲線(xiàn)

• 培養上清測定

• 準備好1毫升新鮮的待測菌液（OD600＝0.5；1 X 10⁸細胞/毫升）
• 移入到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取200微升上清液到1.5毫升離心管
• 加入5微升    染色液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)37℃培養箱里或恒溫水槽孵育30至60分鐘，避免光照
• 轉移到200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板
• 放進(jìn)37℃熒光分光光度儀或熒光酶標儀檢測（激發(fā)波長(cháng)490nm，散發(fā)波長(cháng)530nm）：――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量增高

三、細菌內測定

實(shí)驗開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的    染色液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后移出5微升    染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入200微升    稀釋液（Reagent C），混勻后，標記為    染色工作液，置入冰槽里。然后進(jìn)行下列操作。

• 準備好1毫升新鮮的待測菌液（OD600＝0.5；1 X 10⁸細胞/毫升）
• 移入到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升預冷的    清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 重復實(shí)驗步驟5至7一次
• 加入200微升含有    染色液（Reagent B）和    稀釋液（Reagent C）的    染色工作液，混勻
• 放進(jìn)37℃培養箱里或恒溫水槽孵育30分鐘，避免光照
• 放進(jìn)微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升預冷的    清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入100微升預冷的    清理液（Reagent A），混勻
• 加入100微升    溶解液（Reagent D）
• 上下傾倒混勻數次
• 轉移到200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板
• 放進(jìn)37℃熒光分光光度儀或熒光酶標儀檢測（激發(fā)波長(cháng)490nm，散發(fā)波長(cháng)530nm）：――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量增高
• 或每隔5分鐘測讀一次，持續30分鐘――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量增高
• 構建活性氧和時(shí)間關(guān)系曲線(xiàn)

注意事項

• 本產(chǎn)品為50次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 操作時(shí)，避免污染母液
• 建議染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測分析
• 孵育時(shí)，必須避免光照
• 本產(chǎn)品染色劑不易洗掉，染色持久
• 根據不同菌株類(lèi)型，可以調整    染色工作液的使用劑量（1：100至1：1000容量比），避免過(guò)度染色
• 本公司提供陽(yáng)性對照甲萘醌溶液（12041），觀(guān)察細胞熒光增強現象
• 本公司同時(shí)細菌細胞內活性氧初級熒光測定試劑盒（ 10016.14），滿(mǎn)足不同用戶(hù)需求
• 本公司提供系列活性氧分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰