體液基質(zhì)金屬蛋白酶9活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

  體液基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過(guò)含硫多肽底物以及特定抑制劑存在與否的情況下，受到MMP-2的水解，釋放出巰基，進(jìn)而使用Ellman試劑，產(chǎn)生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物吸光峰值的變化，即采用比色法來(lái)測定體液樣品中酶活性的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗證明的。其適用于各種動(dòng)物和人體體液包括血漿、血清、尿液、腦脊液、唾液、精液等樣品中基質(zhì)金屬蛋白酶9的特異活性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩定，安全可靠。

技術(shù)背景

基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一類(lèi)結構高度同源的分泌型或膜相關(guān)性鋅內肽酶的總稱(chēng)，因含有金屬（鋅、鈣）離子而得名。其功能在于分解細胞外基質(zhì)成分。迄今為止發(fā)現的MMPs至少有28種，幾乎能降解除多糖以外的全部細胞外基質(zhì)（extracellular matrix）成分，同時(shí)參與胚胎發(fā)育、形態(tài)形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、組織再吸收（tissue resorption）、疾病發(fā)生，例如關(guān)節炎、癌細胞浸入轉移等。根據降解的底物不同可將MMPs分為4大類(lèi)：（1）膠原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和蛋白多糖；（2）明膠酶（Ⅳ型膠原酶）：MMP2、MMP9，又稱(chēng)明膠酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和彈性纖維；（3）基質(zhì)溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11、MMP12，主要作用于纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈力纖維、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ膠原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金屬蛋白酶：MT₁-MMP、MT₂-MMP、MT₃-MMP，主要作用于明膠、Ⅳ型膠原、MMP2。體內絕大多數細胞并不儲備MMPs，當需要MMPs的信號傳遞到細胞后才臨時(shí)合成，合成的MMPs以無(wú)活性的酶原（proenzyme）形式分泌到細胞外，隨后被多種蛋白酶和非蛋白酶水解以及熱處理激活，一種激活的MMPs可激活另一種MMPs，形成瀑布效應。基質(zhì)金屬蛋白酶-9，又稱(chēng)明膠酶B（gelatinase-B ）或IV型膠原酶（type IV collagenase），其前體分子量為92kDa，激活后分子量為82kDa以及更小。它的作用目標是天然和變性膠原蛋白（collagens）、纖維連接蛋白（fibronectin）、彈性纖維蛋白（elastin）、層粘連蛋白（laminin）、前體腫瘤壞死因子-α（pro-TNF-α）和白細胞介素及其受體。基質(zhì)金屬蛋白酶-9與腫瘤發(fā)展與轉移、血管形成、斑禿（alopecia）等疾病有關(guān)。基于含硫多肽（thiopeptide）底物Ac-PLG（2-mercapto-4-methyl-pentanoyl）-LG-OC2H5，在特異性抑制劑存在與否的條件下，受到MMP9的水解，釋放出巰基（sulfhydryl group），進(jìn)而與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過(guò)其吸收峰值的變化（412nm波長(cháng)），來(lái)定量測定組織基質(zhì)金屬蛋白酶9的特異活性。基質(zhì)金屬蛋白酶9反應系統為：

產(chǎn)品內容

  緩沖液（Reagent A）  毫升

  反應液（Reagent B）  毫升

  底物液（Reagent C）       微升

  陰性液（Reagent D）   微升

  專(zhuān)性液（Reagent E）   微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)       1份

保存方式

保存  緩沖液（Reagent A）在室溫下；其余的保存在－20℃冰箱里；  反應液（Reagent B）、  底物液（Reagent C）和  專(zhuān)性液（Reagent E）避免光照；有效保證3月

用戶(hù)自備

1.5毫升離心管：用于反應液配制的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品制備

培養箱：用于反應孵育

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實(shí)驗步驟

• 樣品準備

選擇一：血漿樣品

• 準備好肝素或ACD抗凝管（注意：避免使用EDTA抗凝管）
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存

選擇二：血清樣品

1． 準備好不含抗凝劑的儲存管 

• 抽取1毫升血液，置于儲存管里
• 室溫下，靜置30分鐘，直至血液凝結
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血清成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存

選擇三：尿液/腦脊液/唾液/精液樣品 

• 準備好1.5毫升離心管
• 移取1毫升液體到離心管 
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管 
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存

• 測定準備

• 開(kāi)啟并設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(cháng)412nm，間隔1分鐘，讀數15次（共15分鐘），并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；  反應液（Reagent B）和  底物液（Reagent C）避免光照

• （選擇步驟）樣品背景對照測定

• 移取xx微升  緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升  反應液（Reagent B）
• 加入xx微升  陰性液（Reagent D）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入10微升待測樣品（100微克總蛋白）（注意：樣品須清澈） 
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照（15分鐘讀數－0分鐘讀數）

• 樣品總活性測定
  • 移取xx微升  緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
  • 加入xx微升  反應液（Reagent B）
  • 加入xx微升  底物液（Reagent C）
  • 上下傾倒數次，混勻
  • 在37℃溫度下孵育3分鐘
  • 加入10微升待測樣品（100微克總蛋白）（注意：樣品須清澈）
  • 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
  • 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數（15分鐘讀數－0分鐘讀數） 

五、樣品非特異活性測定

檢測開(kāi)始前，移取10微升待測樣品（100微克總蛋白）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升  專(zhuān)性液（Reagent E），混勻后，在37℃溫度下孵育30分鐘，然后置于冰槽里備用

• 移取xx微升  緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升  反應液（Reagent B）
• 加入xx微升  底物液（Reagent C）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升上述預處理的待測樣品 
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數（15分鐘讀數－0分鐘讀數）

六、計算樣品活性

• 樣品活性（總活性或非特異活性）

• 樣品特異活性

• 酶標儀測定

• 樣品總活性檢測

• 在96孔板上做好相應標記：樣品背景（選擇步驟）和樣品活性
• 分別移取xx微升  緩沖液（Reagent A）到96孔板中的所有孔里
• 分別加入xx微升  反應液（Reagent B）到所有孔里
• 加入xx微升  底物液（Reagent C）到樣品活性孔里
• 加入xx微升  陰性液（Reagent D）到樣品背景孔里
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入5微升待測樣品（50微克總蛋白）到所有孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標儀檢測：0分鐘讀數和15分鐘讀數
• 活性計算：

• 樣品非特異性活性檢測

檢測開(kāi)始前，移取5微升待測樣品（50微克總蛋白）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升  專(zhuān)性液（Reagent E），混勻后，在37℃溫度下孵育30分鐘，然后置于冰槽里備用

• 在96孔板上做好相應標記：待測樣品
• 移取xx微升  緩沖液（Reagent A）到96孔板里
• 加入xx微升  反應液（Reagent B）
• 加入xx微升  底物液（Reagent C）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入10微升上述預處理的待測樣品
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標儀檢測：0分鐘讀數和15分鐘讀數
• 活性計算：

• 樣品特異性活性計算

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次（10個(gè)樣本；比色皿）和50次（25個(gè)樣本；96孔板）操作，包括背景對照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統操作過(guò)程中，背景測定只需1次
•   專(zhuān)性液（Reagent E）嚴禁反復凍融；有效期為3個(gè)月
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 樣品準備要點(diǎn)如下：
  • 樣品中避免使用EDTA、EGTA等二價(jià)陽(yáng)離子鰲和劑
  • 樣品中避免使用硫醇抑制劑（THIOL INHIBITOR）
  • 由于樣品中的MMP9主要為酶原形式，檢測前須使用活化劑處理（建議使用  膠原酶潛酶活化劑（APMA）－GMS12197）
• 建議使用比色皿測定
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 加樣后3秒內比色測定
• 測定值由低到高變化；測定可持續15分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 樣本測定15分鐘讀數高于0分鐘讀數表明具有酶活性
• 待測樣本為酶粗提樣品，其蛋白濃度為20微克/50微升；待測樣本為體液懸液，其蛋白濃度為100微克/50微升（本公司提供    Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 如果待測樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調整樣品濃度
• 如果檢測基質(zhì)金屬蛋白酶9抑制劑，在加入  底物液（Reagent C）前，37℃下孵育30分鐘
• 可以檢測部分或*純化酶樣品中基質(zhì)金屬蛋白酶9，則可以省去非特異活性檢測步驟
• 基質(zhì)金屬蛋白酶9酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 7.5的情況下，每單位抑制敏感性酶在單位時(shí)間內（每分鐘）水解1微摩爾的含硫多肽底物
• 本公司提供系列基質(zhì)金屬蛋白酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感