MB50047.3.1 v.A

  細胞組織蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性熒光定量檢測試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

（中文版）

主要用途

  細胞組織蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過(guò)二肽化合物底物z-FR-AMC，在組織蛋白酶L抑制劑的存在下，受到組織蛋白酶B的水解，釋放出熒光產(chǎn)物氨甲基香豆素，即采用熒光法來(lái)測定細胞裂解萃取樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體、植物、昆蟲(chóng)等）組織蛋白酶B（CATHEPSIN B）的特異活性檢測。產(chǎn)品嚴格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩定。

技術(shù)背景

組織蛋白酶（CATHEPSIN），是一種木瓜酶（papain）類(lèi)半胱氨酸或天冬氨酸蛋白酶（Cysteine or Aspartic protease），普遍存在于溶酶體細胞器內，在酸性環(huán)境下激活，切離各種目標蛋白。根據其結構和底物特異性，組織蛋白酶家屬約有十多種成員，包括A、B、C、D、E、G、H、K、L、S等。組織蛋白酶在細胞內蛋白和細胞外蛋白通過(guò)內吞進(jìn)行周轉中起著(zhù)重要作用，同時(shí)也是啟動(dòng)和傳遞細胞凋亡信號的替代機制，以及腫瘤和炎癥性組織損傷的病理生理變化。其中組織蛋白酶B（EC 3.4.22.1），又稱(chēng)為CTSB，作為溶酶體的標志性酶蛋白，可以使β-淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein）轉化為β-淀粉樣蛋白斑點(diǎn)（β-amyloid plaque）在抗原處理（antigen processing）、腫瘤轉移、骨再吸收、細胞內或分泌性調節蛋白周轉、卵細胞成熟、細胞凋亡等方面具有重要作用。細胞間接觸和細胞外基質(zhì)成分影響43kd組織蛋白酶原L轉化為成熟蛋白。組織蛋白酶B使膠原蛋白、結締組織蛋白、β-淀粉樣前體蛋白等降解。與半胱氨酸蛋白酶抑制劑A和B（Cystatin A和B）、S100A10等蛋白相互反應。組織蛋白酶B異常，將導致阿茨罕默綜合癥（Alzheimer's disease）、食道腫瘤（esophageal adenocarcinoma）等疾患。基于人工合成的二肽化合物底物z-FR-AMC（z-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin；乙酰苯丙氨酰精氨酰氨甲基香豆素），在組織蛋白酶L抑制劑Z-FY(t-Bu)-DMK的存在下，受到組織蛋白酶B的水解，釋放出熒光7-氨基-4-甲基香豆素（7-amido-4-methylcoumarin；激發(fā)波長(cháng)360nm；散發(fā)波長(cháng)460nm），來(lái)定量測定組織蛋白酶B的特異活性。組織蛋白酶B反應系統為：

CATHEPSIN B

z-FR-AMC       →          z-FR  +   AMC

             Z-FY(t-Bu)-DMK

產(chǎn)品內容

  清理液（Reagent A） 120毫升

  裂解液（Reagent B）  10毫升

  緩沖液（Reagent C）   2毫升

  底物液（Reagent D）   500微升

  標準液（Reagent E）  50微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)      1份

保存方式

保存  清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；  底物液（Reagent D）和  標準液（Reagent E）避免光照和反復凍融；有效保證6月

用戶(hù)自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細胞刮脫棒：用于脫離貼壁細胞

微型臺式離心機：用于樣品沉淀

培養箱：用于反應物孵育

96孔板或比色皿：用于樣品熒光測定的容器

熒光酶標儀或熒光分光光度儀：用于樣品熒光分析

實(shí)驗步驟

• 樣品制備

• 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入3毫升  清理液（Reagent A），覆蓋生長(cháng)表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升  清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開(kāi)始）
• 放進(jìn)4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升  裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

• 測定準備

• 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液樣品等），置于冰槽里
• 設定好熒光分光光度儀（溫度為37℃）：激發(fā)波長(cháng)360nm，散發(fā)波長(cháng)460nm，并置零 
• 準備好5個(gè)1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 分別加入25微升  緩沖液（Reagent C）到2至5號管
• 移取50微升  標準液（Reagent E）到1號管，混勻
• 小心移取25微升1號管稀釋的  標準液（Reagent E）到2號管，混勻
• 小心移取25微升2號管稀釋的  標準液（Reagent E）到3號管，混勻
• 小心移取25微升3號管稀釋的  標準液（Reagent E）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見(jiàn)下表

• 標準曲線(xiàn)測定

• 移取70微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入20微升  底物液（Reagent D）
• 加入10微升上述配制的標準液
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測：獲得相對熒光讀數（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 重復實(shí)驗步驟1至6四次
• 構建標準曲線(xiàn)：縱座標（Y軸）為相對熒光單位（RFU）；橫座標（X軸）為標準AMC濃度（微摩爾/升）

• 樣品測定

• 移取70微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入20微升  底物液（Reagent D）
• 加入10微升待測樣品（50微克細胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測：獲得樣品相對熒光讀數（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 根據標準曲線(xiàn)獲得樣品對應AMC濃度

• 計算樣品實(shí)際活性

[根據標準曲線(xiàn)獲得樣品對應AMC濃度（微摩爾/升）X樣品稀釋倍數]÷ 60（分鐘）＝納摩爾/毫升•分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝納摩爾/毫克•分鐘

• 酶標儀測定

• 在96孔板上做好相應標記：標準樣品和待測樣品
• 分別移取70微升  緩沖液（Reagent C）到相應孔里
• 分別加入20微升  底物液（Reagent D）
• 分別加入10微升上述配制的標準液或待測樣品（50微克細胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 即刻放進(jìn)熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光讀數
• 構建標準曲線(xiàn)：縱座標（Y軸）為相對熒光單位；橫座標（X軸）為標準AMC濃度（微摩爾/升）
• 根據標準曲線(xiàn)獲得樣品對應AMC濃度
• 樣品實(shí)際活性計算：

根據標準曲線(xiàn)獲得樣品對應AMC濃度（微摩爾/升）X樣品稀釋倍數]÷ 60（分鐘）＝納摩爾/毫升•分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝納摩爾/毫克•分鐘

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統操作過(guò)程中，標準曲線(xiàn)測定只需1次
• 樣品須澄清，且避免反復凍融  
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/10微升（本公司提供    Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 如果待測樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調整樣品濃度
• 孵育反應完成后即刻進(jìn)行熒光測定
• 可以使用組織蛋白酶B抑制劑CA-074作為抑制劑對照或陰性對照
• 組織蛋白酶B單位活性定義為：在37℃，pH 5.5條件下，每分鐘內能夠切離1微摩爾二肽化合物底物z-FR-AMC所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列組織蛋白酶學(xué)檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感