MB10153.2 v.A

  組織線(xiàn)粒體內鈣離子濃度熒光定量檢測試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

  組織線(xiàn)粒體內鈣離子濃度熒光定量檢測試劑是一種旨在通過(guò)線(xiàn)粒體鈣離子特異性熒光探針Rhod-2，與鈣離子結合后，其熒光強度顯著(zhù)增強，在熒光分光光度儀下觀(guān)察相對熒光峰值的變化，來(lái)測定組織線(xiàn)粒體中總鈣離子濃度的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗證明的。其適用于各種組織（動(dòng)物、人體等）內線(xiàn)粒體鈣離子的濃度檢測。產(chǎn)品嚴格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩定，檢測敏感。

技術(shù)背景

鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì)，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細胞內。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結合鈣，其構成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進(jìn)一步分成具有活性的復合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運輸、釋放神經(jīng)傳導介質(zhì)、信使傳導等方面起著(zhù)重要作用。在細胞內，鈣離子主要儲存在線(xiàn)粒體和內質(zhì)網(wǎng)等細胞器中。其中線(xiàn)粒體鈣離子在調節線(xiàn)粒體代謝、保持線(xiàn)粒體的ATP產(chǎn)量達到細胞需求，維持細胞內環(huán)境鈣離子平衡方面起著(zhù)重要作用。線(xiàn)粒體鈣的檢測包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技術(shù)，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求，以及需要線(xiàn)粒體純化。Rhod-2，羅丹明123（rhodamine 123）的衍生產(chǎn)物，一種與鈣離子結合產(chǎn)生熒光，同時(shí)其正電荷特性，特異性地聚集在線(xiàn)粒體里， 由此用于測定線(xiàn)粒體內鈣離子水平。在熒光分光光度儀下，激發(fā)波長(cháng)550nm，散發(fā)波長(cháng)590nm，來(lái)定量測定線(xiàn)粒體的鈣濃度。

產(chǎn)品內容

  清理液（Reagent A）     毫升

  染色液（Reagent B）     微升

  介導液（Reagent C）     微升

  飽和液（Reagent D）     毫升

  陰性液（Reagent E）     毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)     1份

保存方式

保存  染色液（Reagent B）和  介導液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶(hù)自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

細胞培養箱：用于染色孵育

黑色96孔板：用于樣品操作的容器

熒光酶標儀：用于熒光分析

實(shí)驗步驟

• 測定準備

• 設定好熒光酶標儀（22℃）：激發(fā)波長(cháng)550nm，散發(fā)波長(cháng)590nm
• 準備好純化的線(xiàn)粒體樣品，置于冰槽里融化
• 測定開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  染色液（Reagent B）室溫下融化，然后分別移出xx微升  介導液（Reagent C）和xx微升  染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，標記為  染色工作液，并放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。 

二、熒光酶標儀檢測

• 準備1個(gè)黑色96孔板，標記為：線(xiàn)粒體樣品孔、空白對照孔（不含線(xiàn)粒體）、大對照孔（不含線(xiàn)粒體）
• 移取100微升純化線(xiàn)粒體樣品（100微克）到線(xiàn)粒體樣品孔里
• 加入xx微升  飽和液（Reagent D）到大對照孔里
• 加入xx微升  陰性液（Reagent E）到空白對照孔里
• 分別加入xx微升  染色工作液到所有孔里
• 輕輕搖動(dòng)黑色96孔板，混勻
• 室溫下（22℃），孵育30分鐘，避免光照
• 放進(jìn)37℃細胞培養箱里孵育30分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)熒光酶標儀測讀：獲得相對熒光單位（relative fluorescence unit；RFU） 
• 計算樣品線(xiàn)粒體鈣離子濃度

【（樣品RFU－空白對照孔RFU）÷（大對照孔RFU－樣品RFU）】X 570（納摩爾；解離常數）=納摩爾/100微克線(xiàn)粒體

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 避免使用EDTA等處理樣品
• 孵育反應完成后即刻進(jìn)行熒光測定
• 如果待測樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調整樣品濃度
• 檢測敏感度可達納摩爾級鈣濃度范圍
• 可以使用熒光分光光度儀檢測
• 本公司提供系列鈣生化檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感